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上海青霉素提纯是如何实现的?

2019-07-15 16:35

  上海青霉素提纯是如何实现的?上海青霉素提纯可以根据以下步骤进行:

  1、预处理

  发酵结束后,目标产物存在于发酵液中,浓度较低,只有10-30kg/m3,并且含有大量杂质,如高价无机离子(Ca,Mg,Fe离子),菌丝,未用完的培养基,易污染杂菌,产生菌的代谢产物,蛋白质等。因此必须对其进行的预处理,其目的在于浓缩目的产物,去除大部分杂质,利于后续的分离纯化过程,是进行分离纯化的第一个工序。

  2、过滤

  发酵液在萃取之前需预处理,可在发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白(比如明矾),或者调解发酵液pH至蛋白质的等电点以沉淀蛋白,然后经真空转鼓过滤(以负压作过滤推动力)或板框过滤(浮液用泵送入滤机的每个密闭的滤室,在工作压力的作用下,滤液透过滤膜或其它滤材,经出液口排出,滤渣则留在框内形成滤饼,从而达到固液分离目的),除掉菌丝体及部分蛋白。青霉素在常温下易降解,因而发酵液及滤液应冷至10℃以下,过滤收率一般90%左右。

  (1)菌丝体粗长10µm,采用鼓式真空过滤机过滤,滤渣形成紧密饼状,容易从滤布上刮下。滤液pH6.27-7.2,蛋白质含量0.05-0.2%。需要进一步除去蛋白质。

  (2)改善过滤和除去蛋白质的措施:硫酸调节pH4.5-5.0,加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB,0.7%硅藻土为助滤剂。再通过板框式过滤机。滤液澄清透明,进行萃取。

  3、萃取

  青霉素的提取采用溶媒萃取法。这是利用抗生素在不同的pH值条件下以不同的化学状态(游离态酸或盐)存在时,在水及水互不相溶的溶媒中溶解度不同的特性,使抗生素从一种液相(如发酵滤液)转移到另一种液相(如有机溶媒)中去,以达到浓缩和提纯的目的。青霉素分子结构中有一个酸性基团(羧基),青霉素的pKa=2.75,所以将青霉素G的水溶液酸化至pH2.0左右,青霉素即成游离酸。这种青霉素酸在水中溶解度很小,但易溶于醇类、酮类、醚类和酯类,利用这一特性,工业上可用溶媒萃取法从发酵液中分离并提纯青霉素。

  在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中,调节pH至2.0左右,再转入中性水相,反复几次萃取,即可提纯浓缩。选择对青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取2-3次。从发酵液萃取到乙酸丁酯时,pH选择1.8-2.0,从乙酸丁酯反萃到水相时,pH选择6.8-7.4。发酵滤液与乙酸丁酯的体积比为1.5-2.1,即一次浓缩倍数为1.5-2.1。为了避免pH波动,采用硫酸盐、碳酸盐缓冲液进行反萃。发酵液与溶剂比例为3-4。几次萃取后,浓缩10倍,浓度几乎达到结晶要求。萃取总收率在85%左右。

  所得滤液多采用二次萃取,用10%硫酸调pH2.0-3.0,加入醋酸丁酯,用量为滤液体积的三分之一,反萃取时常用碳酸氢钠溶液调pH7.0-8.0。在一次丁酯萃取时,由于滤液含有大量蛋白,通常加入破乳剂防止乳化。第一次萃取,存在蛋白质,加0.05-0.1%乳化剂PPB。

  萃取条件:为减少青霉素降解,整个萃取过程应在低温下进行(10℃以下)。萃取罐冷冻盐水冷却。

  4、脱色

  萃取液中添加活性炭,除去色素、热源,过滤,除去活性炭。

  5、结晶

  萃取液一般通过结晶提纯。青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度很小,在二次丁酯萃取液中加入醋酸钾-乙醇溶液,青霉素钾盐就结晶析出。然后采用重结晶方法,进一步提高纯度,将钾盐溶于KOH溶液,调pH至中性,加无水丁醇,在真空条件下,共沸蒸馏结晶得纯品。

  直接结晶:在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸钠-乙醇溶液反应,得到结晶钠盐。加醋酸钾-乙醇溶液,得到青霉素钾盐。

  共沸蒸馏结晶:萃取液,再用0.5mol/LNaOH萃取,调pH至pH6.4-6.8下得到钠盐水浓缩液。加2.5倍体积丁醇,16-26℃,0.67-1.3KPa下蒸馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、干燥后,得到青霉素产品。

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